聚合酶鏈反應檢驗實驗室是指通過基因擴增的方式檢測特定的DNA或RNA的檢驗實驗室。聚合酶鏈反應（Polymerase Chain Reaction ，PCR）是一種在體外特異性擴增靶DNA序列的技術，其基本過程為模板雙鏈DNA的變性、引物與模板DNA的退火和在DNA 聚合酶引導下的鏈延伸反應三個階段的多次循環(huán)。每一次循環(huán)后的擴增產(chǎn)物均可作為下一輪循環(huán)的模板，理論上，擴增產(chǎn)物量呈指數(shù)形式上升，即經(jīng)過n個循環(huán)后，產(chǎn)物量增加到2n倍。PCR試劑操作簡單，短時間內(nèi)在體外可獲得數(shù)百萬個特異靶DNA序列的復制，為臨床疾病的診斷、治療監(jiān)測和預后評估提供了一種極有幫助的實驗室輔助手段。

PCR檢驗實驗室是PCR試劑生產(chǎn)企業(yè)在產(chǎn)品檢驗過程中不可缺少的工作環(huán)境，其環(huán)境控制水平和質(zhì)量管理水平直接影響著最終產(chǎn)品是否合格，能否放行。由于該產(chǎn)品本身的特殊性，《醫(yī)療器械生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范附錄體外診斷試劑》、《醫(yī)療器械生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范體外診斷試劑現(xiàn)場檢查指導原則》條款中，明確對PCR試劑的生產(chǎn)和檢驗環(huán)境做出規(guī)定。此外現(xiàn)行衛(wèi)生行業(yè)的法規(guī)、標準以及相關文獻中對于PCR檢驗實驗室均作出規(guī)定，主要涉及《全國臨床檢驗規(guī)程》（第三版）、《醫(yī)療機構(gòu)臨床基因擴增管理辦法》（衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)〔2010〕194號）、《醫(yī)療機構(gòu)臨床基因擴增檢驗實驗室工作導則》及《臨床診斷中聚合酶鏈反應（PCR）技術的應用》（WS/T 230-2002）等行業(yè)標準的相關要求。

本檢查指南旨在幫助北京市醫(yī)療器械監(jiān)管人員增強對PCR檢驗相關過程的認知和把握，指導全市醫(yī)療器械監(jiān)管人員對PCR檢驗實驗室設計建設與質(zhì)量控制的監(jiān)督檢查工作。同時，為PCR試劑生產(chǎn)企業(yè)在PCR檢驗實驗室的設計建造和管理要求提供參考。

當國家相關法規(guī)、標準、檢查要求發(fā)生變化時，應當重新討論以確保本檢查指南持續(xù)符合要求。

一、適用范圍

本檢查指南可作為北京市食品藥品監(jiān)督管理局組織、實施的體外診斷試劑產(chǎn)品注冊質(zhì)量管理體系現(xiàn)場核查、《醫(yī)療器械生產(chǎn)許可證》現(xiàn)場核查、醫(yī)療器械生產(chǎn)監(jiān)督檢查等各項涉及PCR檢驗實驗室檢查的參考資料。基因測序檢驗實驗室等涉及PCR試劑的相關部分應當參照本檢查指南執(zhí)行。

二、檢查要點

（一）現(xiàn)場查看生產(chǎn)企業(yè)PCR檢驗實驗室布局

生產(chǎn)企業(yè)應當提供PCR檢驗實驗室設計方案和/或平面設計圖（應當標明風向或壓差梯度）。

1.PCR檢驗實驗室與PCR試劑生產(chǎn)區(qū)域應當在各自獨立的建筑物或空間內(nèi)，保證空氣不直接聯(lián)通，防止擴增時形成的氣溶膠造成交叉污染。

2.原則上PCR檢驗實驗室應當設置以下區(qū)域：試劑儲存和準備區(qū)、標本制備區(qū)、擴增區(qū)、擴增產(chǎn)物分析區(qū)。根據(jù)使用儀器的功能，區(qū)域可適當合并。若使用實時熒光定量PCR儀且不需要進行后續(xù)產(chǎn)物分析工作，擴增區(qū)、擴增產(chǎn)物分析區(qū)可合并。若使用樣本處理、核酸提取及擴增檢測為一體的自動化分析儀，則標本制備區(qū)、擴增區(qū)、擴增產(chǎn)物分析區(qū)可合并。

3.各區(qū)域在物理空間上應當完全相互獨立，各區(qū)域無論是在空間上還是在使用中，應當始終處于完全的分隔狀態(tài)。不應當只是形式上的分區(qū)，不應當是一個區(qū)域嵌套一個區(qū)域。

4.各區(qū)域不應當有空氣的直接相通。擴增區(qū)與擴增產(chǎn)物分析區(qū)各區(qū)域宜采用獨立直排方式出風。采用空調(diào)機組方式的，PCR檢驗實驗室應當具備獨立空調(diào)機組；同時應當考慮停機后各房間空氣連通的可能性，采取必要的控制措施。

5.按照試劑儲存和準備區(qū)→標本制備區(qū)→擴增區(qū)→擴增產(chǎn)物分析區(qū)方向空氣壓力應當以遞減的方式進行，使得PCR檢驗實驗室的空氣流向應當按照試劑儲存和準備區(qū)→標本制備區(qū)→擴增區(qū)→擴增產(chǎn)物分析區(qū)方向進行，防止擴增產(chǎn)物順空氣氣流進入擴增前的區(qū)域。空氣流向應當為單向，禁止下游污染上游。應當設置合理的壓差梯度，并安裝壓差監(jiān)測裝置，以有效證明空氣流向，壓差梯度不宜低于5帕。

6.設置緩沖間的，緩沖間內(nèi)通向內(nèi)實驗室和走廊的門應當安裝連鎖裝置或采取相應措施，避免出現(xiàn)兩個門同時打開的情況。

7.各區(qū)間若設置傳遞窗，應當為雙側(cè)開門，要求密封嚴實，并且兩側(cè)的門應當為互鎖裝置或采取相應措施保證兩側(cè)門不會同時開啟。

（二）現(xiàn)場查看儀器設施配置

1.試劑儲存和準備區(qū)的功能：貯存試劑的制備、試劑的分裝和擴增反應混合液的準備，以及離心管、吸頭等消耗品的貯存和準備。

配套用品一般應當包括：

（1）溫度調(diào)控范圍為2℃～8℃和（或）-20℃以下冰箱；
（2）混勻器；
（3）微量加樣器；
（4）紫外消毒設備；
（5）消耗品：一次性手套、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭；
（6）專用工作服和工作鞋(套)；
（7）專用辦公用品。

2.標本制備區(qū)的功能：核酸（RNA、DNA）提取、貯存及加樣。

配套用品一般應當包括：

（1）溫度調(diào)控范圍為2℃～8℃和（或）-20℃以下冰箱；
（2）高速離心機；
（3）混勻器；
（4）水浴箱或加熱模塊；
（5）微量加樣器；
（6）紫外消毒設備；
（7）生物安全柜；
（8）消耗品：一次性手套、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭（帶

濾芯）；
（9）專用工作服和工作鞋(套)；
（10）專用辦公用品；
（11）如需處理大分子DNA，應當具有超聲波儀。

3.擴增區(qū)的功能：cDNA合成、DNA擴增及檢測。配套用品一般應當包括：

（1）核酸擴增儀；
（2）微量加樣器；

（3）紫外消毒設備；
（4）消耗品：一次性手套、一次性帽子、耐高壓處理的離心管和

加樣器吸頭（帶濾芯）；
（5）專用工作服和工作鞋；
（6）專用辦公用品。

4.擴增產(chǎn)物分析區(qū)的功能：擴增片段的進一步分析測定。視檢驗

方法不同而定，基本配置如下：
（1）微量加樣器；
（2）紫外消毒設備；
（3）消耗品：一次性手套、一次性帽子、加樣器吸頭（帶濾芯）；
（4）專用工作服和工作鞋；
（5）專用辦公用品。

5.設備的維護保養(yǎng)

    應當建立設備維護保養(yǎng)規(guī)程，計量設備應當定期檢定。例如核酸擴增儀、微量加樣器、生物安全柜、離心機應當每年進行檢定或校準工作。

（三）現(xiàn)場檢查工作流程及注意事項

1.進入各工作區(qū)域應當嚴格按照單一方向進行，即試劑儲存和準備區(qū)→標本制備區(qū)→擴增區(qū)→ 擴增產(chǎn)物分析區(qū)。
2.各工作區(qū)域必須有明確的標記，不同工作區(qū)域內(nèi)的設備、物品不得混用。
     3.不同工作區(qū)域的工作服應當加以區(qū)分，不得混用（例如可以采用不同顏色）。

4.實驗室的清潔應當按照試劑貯存和準備區(qū)→標本制備區(qū)→擴增區(qū)→擴增產(chǎn)物分析區(qū)的方向進行。不同的實驗區(qū)域應當有其各自的清潔用具并防止交叉污染。實驗垃圾屬于醫(yī)療廢物的應當按照《醫(yī)療廢物管理條例》相關規(guī)定進行處理。

5.工作結(jié)束后，應當立即對工作區(qū)進行清潔及消毒。

6.貯存試劑和用于標本制備的消耗品等材料應當直接運送至試劑貯存和準備區(qū)，不能經(jīng)過擴增檢測區(qū)。應當對加樣吸頭、PCR反應管等消耗品處理，防止污染。試劑盒中的陽性對照品及質(zhì)控品應當保存在標本處理區(qū)。試劑應當使用分子生物學級別試劑，使用的純化水應當高壓滅菌。質(zhì)檢用于原輔料、半成品、成品檢驗用的PCR反應試劑應當有相應的質(zhì)量標準及操作程序。

7.為避免樣本間的交叉污染，加入待測核酸后，應當蓋好含反應混合液的反應管。應當注意PCR反應液加樣的順序，應當為空白樣品→陰性對照→樣品→陽性對照。對具有潛在傳染危險性的材料，應當在生物安全柜內(nèi)開蓋，并有明確的樣本處理和滅活程序。

8.應當避免氣溶膠所致的污染，盡量減少在擴增區(qū)內(nèi)的走動，擴增反應管不得在擴增區(qū)打開。

9.擴增產(chǎn)物分析區(qū)有可能存在某些可致基因突變和有毒物質(zhì)如溴化乙錠、丙烯酰胺、甲醛或放射性核素等，應當注意實驗人員的安全防護。

（四）現(xiàn)場檢查人員培訓情況

參與PCR檢驗的工作人員應當具備相應的專業(yè)知識和技能，包括能熟練操作相關設備,明確整個工作的流程,掌握出現(xiàn)污染情況的處理方法以及實驗室質(zhì)量控制方法和檢測結(jié)果的解釋。

檢查人員可以通過詢問或要求人員實際操作對其進行評價，也可以通過查閱人員培訓記錄，對其進行評價。

（五）現(xiàn)場檢查文件情況

在檢查過程中應當特別注意現(xiàn)場查看、詢問、記錄的實際情況與生產(chǎn)企業(yè)的文件規(guī)定、記錄的符合性。